胚胎移植的技术方法-羊的繁殖新技术

胚胎移植的技术程序包括:供、受体选择,供、受体同期发情处理、超数排卵、供体的配种、胚胎采集、胚胎的检查与鉴定、胚胎的移植等。

1.供体的选择

①供体应具备遗传优势,在育种上有价值,应选择生产性能好、经济价值高的羊作为供体。

②供体应具有良好的繁殖能力。供体既往繁殖史好、易配易孕,繁殖史上没有遗传缺陷,分娩顺利,无难产或胎衣不下现象,生殖器官无繁殖疾病,发情周期正常、发情征兆明显。

③供体营养良好,体质健壮,健康无病。

2.受体的选择

受体母羊可选用非优良品种的个体或地方品种应具有良好的繁殖性能和健康状态,体型中上等。在拥有大量母羊的情况下,可以选择自然发情与供体发情时间相同或相近的母羊,一般两者发情时间差不宜超过±24h。由于往往不易找到足够的合适的母羊作为受体,所以大都需要对供体和受体进行同期发情处理。

3.供、受体同期发情处理

见发情控制技术。

4.供体发情鉴定与配种

超排处理后,要密切观察供体羊的发情征兆。在胚胎移植实践中,发情鉴定方法主要以接受爬跨站立不动为主要判定依据。每天早、中、晚对供体认真观察3次,第一次观察到接受爬跨而站立不动的时间即是配种的参考点,此时为0时,由于超排处理后排卵数较正常发情供体多且排卵时间不一致,再加上精子和卵子的运行受超排处理的影响,为确保卵子受精,常采取增加输精次数,加大每次输精剂量的方法。

5.采集时间的确定

胚胎的采集又叫胚胎的收集,也称采胚、冲胚、采卵或冲卵。胚胎的采集就是利用冲胚液将胚胎由生殖道(输卵管或子宫)中冲出,并收集在器皿中。胚胎采集有手术和非手术两种方法。前者适用于各种家畜,后者仅适用于牛、马等大型家畜,且只能在胚胎进入子宫角以后进行。目前,生产中羊胚胎的采集通常采用手术法。

采胚时间要考虑到配种、排卵的大致时间,胚胎的运行速度和胚胎在生殖道的发育速度等因素。只有这样,才能适时、准确地进行操作,得到较高的采胚率。

采胚时间不应早于排卵后的第1d,亦即最早要在发生第1次卵裂之后,否则不易辨别卵子是否已受精。一般是在配种后3~8d,胚胎发育至4~8细胞以上时为宜。

6.羊的手术法胚胎采集

羊手术采(冲)胚大多在供体羊发情配种后的2~6d进行。

(1)输卵管采胚法

将冲胚管(内径为2mm的塑料导管)一端由输卵管伞部的喇叭口插入2~3cm深,用钝圆的夹子固定,另一端接集胚皿。用10mL或20mL注射器吸取37℃的冲胚液5~10mL,在子宫角靠近输卵管的部位,将针头向输卵管方向扎入,一人操作时,一只手在针头后方捏紧子宫角,另一只手推压注射器,使冲胚液由子宫与输卵管结合部流入输卵管,经输卵管流入集胚皿。

该法的优点是胚胎回收率高,冲胚液用量少,检卵省时间;缺点是容易造成输卵管特别是伞部的粘连和损伤,甚至影响繁殖能力。

操作注意事项:第一,针头从子宫角进入输卵管时必须仔细。要看清输卵管的走向,留心输卵管与周围系膜的区别,只有针头在输卵管内进退通畅时,才能冲胚。第二,冲胚时要注意将输卵管,特别是针头插入的部位尽量撑直,并保持在一个平面上。第三,推注冲胚液的力量和速度要持续而适中,过慢或停顿易使胚胎滞留在输卵管弯曲和皱襞内,影响胚胎回收率;用力过大,可能造成输卵管壁的损伤,可能使固定不牢的冲胚管脱落和冲胚液倒流。第四,冲胚时要避免冲胚的针头刺破输卵管附近的血管,把血带入冲胚液,给检胚造成困难,故冲胚管的针头稍钝些为好。

(2)子宫采胚法

该法分为导管法和冲胚管法两种。

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图2.2.6 羊二路式冲胚管剖面结构
A.气路 B.水路 1.进出水路 2.气囊 3.进出水通道

①导管法。导管法又可分为两种:第一种方法是:术者将羊子宫暴露于创口外,肠钳(套上胶皮套)夹在子宫角分叉处,注射器吸入37℃的20~30mL冲胚液(一侧多的可用液50~60mL),用钝性针头从一侧子宫角尖端插入,推注冲胚液,将回收胚针头从肠钳钳头基部的上方扎入,冲胚液经导管收集于集液杯内。另一侧子宫角用同样方法冲洗。第二种方法是:在一侧子宫角的顶端靠近输卵管的部位用钝的针头刺开一个小口,然后由此口插入冲胚管并使之固定,冲胚管下接集胚管。在子宫角与子宫体相邻的远端将装有37℃的20~30mL冲胚液的注射器插入,针头后方的子宫角用手指捏紧,迅速推注冲胚液,使之经过子宫角流入集胚管。另一侧子宫角用同样方法冲洗。后法也可由2人配合进行。工作人员甲自子宫角近输卵管的一段插入一个连有12号针头的注射器,封死子宫向输卵管的通路,在工作人员乙推冲胚液的同时,甲抽拉注射器,使子宫角内形成负压,这样配合得当,冲胚液易携同子宫内的胚胎一并进入甲的注射器中。子宫采胚法对输卵管的损害甚微,尤其不涉及伞部,但其缺点是胚胎回收率较输卵管采胚法低,用液较多,检胚费时。

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图2.2.7 羊冲胚管法冲胚示意图

②冲胚管法。冲胚管法有两种。一种方法是:手术暴露子宫,在一侧子宫角基部扎孔,将冲胚管(二路式冲胚管剖面结构如图2.2.6所示)插入。用注射器注入气体5~10mL,使气囊在子宫角基部固定,然后由冲胚管进液孔,分次进液冲洗子宫角,每次进液10~20mL,一侧用液50~60mL,将回收液接于平皿中。用同样的方法冲洗另一侧子宫角。另一方法是:术者先在暴露的一侧子宫角基部,用止血钳或镊子等穿透子宫角壁,然后将冲胚管插入子宫角方向,根据子宫角基部内径的大小经冲胚管的气路给冲胚管充气5~10mL,鼓起气囊使之固定,以起到阻止冲胚液流入阴道内的作用。冲胚管末端接集胚皿。再在子宫角尖端用套管针插入子宫角腔内,拔出针芯,接上装有37℃20~40mL冲胚液的注射器,注入冲胚液进行冲胚(注意:注射器推动时稍有阻力,匀速注入冲胚液)。集胚皿要端平,将冲胚管的水道放在集胚皿中。冲胚液注完后拔出套管针,待冲胚液将近流尽时,用拇指、食指和中指稍挤压子宫角让冲胚液尽量流尽。然后给冲胚管放气,拔出冲胚管,并将其中的冲胚液挤入集胚皿中。用同样方法冲取另一侧子宫角内的胚胎(见图2.2.7)。然后在子宫角尖端、子宫角基部及其他部位涂上碘甘油或灭菌液状石蜡,防止粘连。把子宫送回腹腔内。

操作注意事项:第一,在子宫角尖端插入套管针或其他冲胚管时,确定确实插入子宫角腔内再注射冲胚液,以免冲胚液注入到子宫浆膜与黏膜之间,使冲胚失败;第二,冲胚管气囊大小要合适,气囊太小起不到固定和阻止冲胚液流入阴道内的作用,气囊太大会使子宫壁受压过大而损伤,并且此处的气囊易坏;第三,注入冲胚液时一定要匀速推注,阻力大时要调整套管针的位置或冲胚管的位置使之通畅。

7.胚胎检查与鉴定

(1)胚胎检查方法

胚胎的检查和鉴定是两个不同的概念。胚胎的检查是指在立体显微镜下,从冲胚液中寻找胚胎。胚胎的鉴定则是将检查的胚胎应用各种手段对其质量和活力进行评定(或等级分类)。

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图2.2.8 胚胎品质的衡量示意图

为了减少体外不利因素对胚胎造成的影响,从母羊生殖道冲出来的冲胚液应保持在37℃环境中,冲胚结束后将冲胚液置于30℃的无菌箱中,最好在箱内检查,如果条件不具备,可在20~25℃的无菌操作室内检查。为了缩短检胚时间,最好用2~3台立体显微镜同时检查。因冲胚液量比较大(几百毫升),全部检查花费时间太多,故采取两种方法,既不让胚胎丢失又能节省时间。一种方法是静置法:把盛冲胚液的容器在无菌室内静置20~30min,胚胎下沉到容器底部,然后将上面的冲胚液吸出,剩下几十毫升即可,然后将这些冲胚液倒入平皿或表面皿,在立体显微镜下检查,为防止胚胎黏到容器上,要用冲胚液冲洗容器,这部分单独倒入平皿检查。另一种方法是采用带有网格(直径小于胚胎直径)的过滤器放入冲胚液中,由上往下吸出冲胚液,最后剩下几十毫升即可,为防止胚胎吸附在过滤器上,用冲胚液反复冲洗过滤器。按上述方法进行处理后,在体视镜下观察,绵羊早期胚胎的直径为150μm左右。检查出的胚胎用吸胚器移入含有20%犊牛血清的PBS中进行鉴定。

胚胎一般分为A、B、C、D四个等级,等级示意图如图2.2.8所示。

①A级。胚胎发育阶段与胚龄一致,胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,无游离的细胞液泡或很少,变性细胞比例<10%。

②B级。胚胎发育阶段与胚龄基本一致,轮廓清晰,分裂球大小基本一致,色调和透明度及细胞密度良好,可见到一些游离的细胞和液泡,细胞占10%~30%。

③C级。胚胎发育阶段与胚龄不太一致,轮廓不清晰,色调变暗。结构较松散,游离的细胞或液泡较多,变性细胞达30%~50%。

④D级。有碎片的卵、细胞无组织结构,变性细胞占胚胎大部分,约75%。

A、B、C级胚胎为可用胚胎,D级为不可用胚胎。

(2)胚胎的评定

移植前正确鉴定胚胎的质量,是移植能否成功的关键之一。目前鉴定胚胎质量和活力的途径主要以形态学方法为主,一般是在50~80倍的实体显微镜下或120~160倍的生物显微镜下进行综合评定,评定的主要内容是:

①卵子是否受精。未受精卵的特点是透明带内分布匀质的颗粒,无卵裂球(胚细胞)。

②透明带的规则性。即形状、厚度、有无破损等。

③胚胎的色调和透明度。

④卵裂球的致密程度,细胞大小是否有差异以及变性情况等。

⑤卵周间隙是否有游离细胞或细胞碎片。

⑥胚胎本身的发育阶段与胚胎日龄是否一致,胚胎的可见结构,如胚结(内细胞团)、滋养层细胞、囊胚腔是否明显可见。

应该指出,形态鉴定在很大程度上是凭经验进行鉴定,因此往往也带有一定的主观性。另外,细胞的形态和内在的生命力并不完全存在必然的相关性,单靠胚胎的形态不能完全说明其活力。但是由于形态鉴定胚胎方法简单易行,如果观察者经验丰富,此方法还是相当可靠的。由于形态学鉴定胚胎有上述优点,在胚胎移植实践中广泛采用。

目前胚胎鉴定的方法除形态学方法外,还有体外培养法、荧光(活体染色)法、测定代谢活性和胚胎的细胞计数等方法,但因设备投入大,测定复杂,在生产实践中应用较少。

8.胚胎移植操作方法

胚胎移植(ET)也叫胚胎的植入,是整个胚胎移植技术中的关键环节之一。所以,一定要按照胚胎移植的规程操作。胚胎移植操作有手术法和非手术法两种。最早采用手术法移植其妊娠率较高,近年来由于移植器械的改进和移植技术的提高。

(1)手术法胚胎移植

手术法移植分为输卵管移植和子宫移植两种。受体羊的术前准备和手术操作同供体羊。吸胚胎时,先用检胚吸管吸入一段培养液,再吸一个小气泡,然后吸取胚胎,胚胎吸取后再吸一个小气泡,最后吸一段培养液。这样,可以防止移动吸管时丢失胚胎。

①输卵管移植。将卵巢上有黄体的一侧或黄体好的一侧的输卵管引出,找到喇叭口并固定好,将吸有胚胎的移植枪头由喇叭口插入2cm,注入胚胎。输卵管移植可直接使用检胚吸管如图2.2.9所示。按输卵管移植的方法吸取胚胎后插入喇叭口如图2.2.10所示,把胚胎送入输卵管。也可用一个截断的12号针头,接一段外径1~1.5mm的塑料软管或硅胶管,再接在1mL的注射器上吸取和移植胚胎。然后,把输卵管送回腹腔内。

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图2.2.9 检胚吸管

1.吸管 2.乳胶管 3.玻璃珠

图2.2.10 山羊手术法

A.子宫移胚器 B.将胚胎移入子宫 C.将胚胎输卵管

1.移植叶 2.硅胶管 3.吸有胚胎的移胚管

输卵管移植前要注意:输卵管前接近伞部处往往因输卵管系膜的牵连形成弯曲,不利于移胚。因此,术者应使伞部的输卵管处于较直的状态,以使牵出的输卵管部分处于输卵管系膜的正上面,术者能见到喇叭口的一侧。此时,术者将移胚管前端插入输卵管内,然后缓缓加大移胚管内的压力,把带有胚胎的保存液输入输卵管内。若移胚管内液体过多,则多量的液体进入输卵管时会引起倒流,易导致胚胎流失。输卵后一定要保持输卵时的指压,抽出移胚管。若在输卵管内放松移胚管的指压,移胚管内的负压就会将输卵管内的胚胎再吸出来。为了保证移胚确实,移胚后还要再镜检移胚管,观察是否还有胚胎的存在,若没有则说明已移入,就可将输卵管等送回腹腔。

②子宫移植(包括腹腔镜移植)。将卵巢上有黄体的一侧或黄体好的一侧的子宫角尖端固定好,用曲别针钝头等细钝性物在子宫角上1/3无血管处刺透子宫角壁,然后将移植枪头从针孔插入子宫腔内,摆动枪头,确认枪头在子宫腔内时,推动连接移胚管的注射器活塞注入胚胎,然后撤出移胚管,最后把子宫角送回腹腔内。

③腹腔镜手术移植。腹腔镜的主体是观察镜(望远镜和内窥镜)镜筒、光导纤维和光源系统。另外,配有组合套管和针以及送气、排气、照相、电视监测及录像系统等附件。由于内窥镜可以插入腹腔,直接观察腹腔内脏器,因此在兽医临床上常用以检查卵巢、子宫的状态,并配合其他技术,进行活体采卵、输精和胚胎移植等。羊的胚胎移植可用腹腔镜进行。对受体羊停饲8~12h,术前进行全身麻醉或局部麻醉,仰卧保定(应使羊头部斜向下方,后躯抬高,以便更好地暴露生殖器官)。检查术部,按外科手术方法除毛消毒,在耻骨前缘腹中线旁两侧皮肤上各做一个小切口。在一个切口内将消毒套管针穿过切口刺入腹腔,接上送气胶管后向腹腔内轻轻打气,压迫胃肠前移,拔出套管针内芯后,向导管针外壳内插入内窥镜,接上光源后即可对卵巢进行搜索观察。在另一个切口内插入手术钳或卵巢固定钳或拨棒等帮助寻找卵巢。找到卵巢后观察其上面有无黄体,有黄体者就将该侧的输卵管或子宫拉出切口外,按上述方法进行输卵管移植或子宫移植,如两侧均无黄体者就淘汰。移胚结束后,慢慢取出各种器械,从排气孔放出腹腔内气体,最后拔出套管针外壳。整个过程要注意严格消毒、预防感染,必要时可缝合切口。

目前,绵羊和山羊的采胚和移胚基本上使用手术方法。借助腹腔镜可以进行采胚和移胚,虽然目前成功率稍低于手术方法,但可以通过改进器械或操作方法提高成功率,更重要的是可以避免反复手术可能造成的损伤。

(2)非手术法胚胎移植

羊的非手术移植妊娠率低,还未能在生产实践中应用,有待进一步研究。

9.供、受体的护理与观察

供、受体处理后不仅要注意它们的健康状况,同时要留心观察它们在预定的时间是否发情。受体若表现发情,也不要急于输精,因为有个别受体妊娠后也有发情表现,应做阴道和直肠检查确定是移植失败真发情时才能输精。如果未见发情则需进一步观察和检查,如果确定妊娠,则需要加强饲养管理和保胎防流产工作,并按预产期做好接产和仔畜护理工作。对供体,在下次发情时即可配种,如计划重复做供体,需经2个月左右的恢复时间。